RNA的提取方法步驟及原理

操作步驟

1.樣品處理

a. 植物組織:取新鮮或-70℃凍存100mg組織在液氮中研磨，把粉末加入到1ml裂解液中混勻。

b. 動(dòng)物組織:取新鮮或-70℃凍存100mg組織加1ml裂解液，用組織研磨杵或勻漿器勻漿處理。

c. 貼壁細(xì)胞:直接在培養(yǎng)板中加入裂解液裂解細(xì)胞，每106細(xì)胞加1ml 裂解液。用取樣器吹打混勻。

d. 細(xì)胞懸液:離心收集細(xì)胞。每106動(dòng)物、植物和酵母細(xì)胞或每107細(xì)菌細(xì)胞加1ml裂解液混勻。

e. 血液處理:取0.2-1ml新鮮血液加3倍體積紅細(xì)胞裂解液，混勻后室溫放置10分鐘， 10000rpm離心1分鐘。棄上清，若沉淀含有紅細(xì)胞，可加入2倍體積紅細(xì)胞裂解液重復(fù)裂解步驟。離心后沉淀加入1 ml裂解液混勻。

2. 將處理后的樣品在室溫放置5分鐘，使得核酸蛋白復(fù)合物完全分離。

3. 向勻漿樣品中加0.2ml氯仿，蓋好管蓋，劇烈振蕩15秒，室溫放置3-5分鐘。

4. 2-8℃ 12000rpm離心10分鐘。RNA主要在上層無色的水相中，把水相轉(zhuǎn)移到新管中，不要吸到沉淀。

5. 吸附柱前處理:在吸附柱中加入500ul 洗柱液，室溫放置2分鐘，2-8 12,000 rpm ℃ 離心2min，棄廢液。

6. 第4步收集的上清中加入200ul無水乙醇混勻，加入吸附柱靜置2分鐘，2-8 12000rpm ℃ 離心2min，棄廢液。

7. 向吸附柱中加入600ul漂洗液(使用前請(qǐng)先檢查是否已加入無水乙醇)，2-8 12,000 rpm ℃ 離心2min，棄廢液。

8. 向吸附柱中加入600ul漂洗液，2-8 12,000 rpm ℃ 離心2min，棄廢液。

9. 12000rpm離心2min，棄掉收集管，將吸附柱置于室溫放置數(shù)分鐘將吸附柱中殘余的漂洗液去除。

10. 將吸附柱放入新管中，向膜中央滴加50-100ul RNase free ddH2O，室溫放置5min，12000rpm室溫離心2min即得到RNA。

RNA抽取一般使用Trizol法抽提:

Trizol是一種總RNA抽提試劑，內(nèi)含異硫氰酸胍等物質(zhì)，能迅速裂解細(xì)胞，抑制細(xì)胞釋放出的核酸酶活性。目前常用Trizol法進(jìn)行提取組織或細(xì)胞中的RNA。

Trizol作用原理:

在勻質(zhì)化或溶解樣品中，Trizol試劑可保持RNA的完整性，同時(shí)能破壞細(xì)胞及溶解細(xì)胞成分。加入氯仿離心后，裂解液分層成水相和有機(jī)相。RNA存在于水相中。

水相轉(zhuǎn)移后，RNA通過異丙醇沉淀回收。移去水相后，用乙醇可從中間相沉淀得到DNA，加入異丙醇沉淀可從有機(jī)相得到蛋白質(zhì)。

擴(kuò)展資料

與DNA不同，RNA一般為單鏈長(zhǎng)分子，不形成雙螺旋結(jié)構(gòu)，但是很多RNA也需要通過堿基配對(duì)原則形成一定的二級(jí)結(jié)構(gòu)乃至三級(jí)結(jié)構(gòu)來行使生物學(xué)功能。

RNA的堿基配對(duì)規(guī)則基本和DNA相同，不過除了A-U、G-C配對(duì)外，G-U也可以配對(duì)。

在細(xì)胞中，根據(jù)結(jié)構(gòu)功能的不同，RNA主要分三類，即tRNA(轉(zhuǎn)運(yùn)RNA)，rRNA(核糖體RNA)，mRNA(信使RNA)。mRNA是合成蛋白質(zhì)的模板，內(nèi)容按照細(xì)胞核中的DNA所轉(zhuǎn)錄;tRNA是mRNA上堿基序列(即遺傳密碼子)的識(shí)別者和氨基酸的轉(zhuǎn)運(yùn)者;rRNA是組成核糖體的組分，是蛋白質(zhì)合成的工作場(chǎng)所。

注意事項(xiàng)

所有相關(guān)器皿耗材都應(yīng)為RNase-free產(chǎn)品，操作過程要小心，帶口罩、手套避免環(huán)境中RNA酶污染樣品。

RNA在水溶液中OD值可能在1.5-1.9之間，但這并不表示RNA不純，需電泳檢測(cè)。

使用時(shí)一定要根據(jù)自己的實(shí)驗(yàn)需要購(gòu)買專用提取試劑盒， 如果不是專用試劑盒，或許能提出RNA，但不能確保其質(zhì)量以及完整性，會(huì)影響RT-PCR、Northern blot、Dot blot、Real time RT PCR、芯片分析、polyA 篩選、體外翻譯、RNase 保護(hù)分析、分子克隆等后續(xù)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果。

當(dāng)前提取效果好的是RNA提取試劑盒，但其售價(jià)較高，單次實(shí)驗(yàn)費(fèi)用花費(fèi)太大，對(duì)精度要求不高的實(shí)驗(yàn)沒有必要購(gòu)買，當(dāng)然還有其它的進(jìn)口試劑盒，但是均存在價(jià)格高、訂貨周期長(zhǎng)的問題(如果碰上國(guó)內(nèi)無貨的時(shí)候，要從國(guó)外發(fā)貨，會(huì)等很長(zhǎng)一段時(shí)間)。普通的提取實(shí)驗(yàn)用國(guó)產(chǎn)的試劑盒就足以，價(jià)格不高，基本上各地均有現(xiàn)貨。